ChIP实验的三大法宝

在基因调控领域，可以说没有比表观遗传学更热的话题了。而染色质免疫共沉淀ChIP是表观遗传学研究中最常用的方法。  

ChIP通过针对染色质相关蛋白（组蛋白、转录因子等）的抗体，来鉴定与该蛋白（或蛋白修饰）相连的序列。这种方式能够帮助人们定位基因组中发生的表观遗传学改变。举例来说，针对H3K4me3（赖氨酸-4上的组蛋白H3三甲基化）的抗体可用来检测活跃表达的基因，而针对H3K27me3的抗体可用于检测沉默的基因。

类似的技术还包括RIP（RNA免疫沉淀）和MeDIP（甲基化DNA免疫沉淀）。RIP可以帮助人们鉴定，与特定RNA结合蛋白相连的RNA。而MeDIP技术允许研究者pull down甲基化的染色质序列。

 

与绝大多数实验方法相同，ChIP也遵循着GIGO原则（Garbage in, garbage out）。如果你的染色质原材料不佳，当然就很难得到理想的实验结果。同时如果你的原材料OK,下一步片段化处理没有做好，仍然是徒劳。

 

目前人们一般通过超声或者酶切将染色质片断成几百Bp，但普通超声破碎仪很难拿捏。超声时间过长或力度过强都会令蛋白变性，使其与核酸分离或者破坏抗体识别的抗原表位。这种方案需要进行大量的优化，但过多的参数（比如四个需要考虑的关键参数：细胞密度、超声力度、超声时间和循环数）往往令人难以下手。幸亏目前有一款超声破碎仪，那就是Diagenode公司生产的Bioruptor 高通量非接触式超声破碎仪，他一次最多可以处理12个样品，由于它可以处理多个样品，把复杂的多参数影响直观数据化，解决了繁杂的参数误差，做到准确可控，快速获得最佳实验条件，从而获得更加准确的实验数据，很多科研人员称它为ChIP实验的神器、金标准，可谓名副其实。

另外有些科研人员喜欢用酶切的方法，酶切的方法其实可以加入超声步骤，超声有助于从细胞核释放更多的染色质。不过为了简单直接，单纯的酶切处理更为普遍。 要说明的是，酶学片段化方案也存在着一定的弊端，因为核酸酶有时会表现出序列偏好，从而影响结果的真实性。另外，酶学消化也并不总能与甲醛交联（ChIP的一个关键步骤）兼容。

 

二、保证抗体的质量  

用来进行pull-down的抗体，是成功ChIP的另一个关键因素。与Western blot相比核酸IP对抗体的要求更多。举例来
说，Western blot抗体识别的是变性蛋白。但在ChIP应用中，你需要确保抗体识别蛋白的三级结构或者一个暴露的抗原表位。

最好的办法是选择一款经ChIP（或RIP或MeDIP）验证的抗体。例如，Digenode公司提供一系列已验证的抗体。该公司致力于表观遗传学研究的服务领域，生产高品质的抗体，同时也为ChIP实验设计了Bioruptor系列超声剪切产品。确保使用高质量的抗体，是ChIP实验成功的关键，不可迁就，舍本求末。

 

ChIP一般使用体外培养的细胞，每次反应所需的细胞量因地制宜。现在，人们常常需要研究更为特殊的样本，例如肿瘤、组织活检样本、干细胞、已存档的FFPE样本（甲醛固定石蜡包埋）、流式细胞分选或激光捕获显微切割所富集的细胞。在这些情况下实验所需的细胞量取决于研究的对象，组蛋白修饰比较丰富，需要的样本量也就相对较少。而转录因子丰度较低，一般需要大约一百万细胞，不过如果信噪比高，那么样本量也可以适当减少。