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ChIP实验的三大法宝

 

 

 

ChIP实验的三大法宝
点击次数:1486 发布日期:2016-1-6  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
在基因调控领域,可以说没有比表观遗传学更热的话题了。而染色质免疫共沉淀ChIP是表观遗传学研究中最常用的方法。  

ChIP通过针对染色质相关蛋白(组蛋白、转录因子等)的抗体,来鉴定与该蛋白(或蛋白修饰)相连的序列。这种方式能够帮助人们定位基因组中发生的表观遗传学改变。举例来说,针对H3K4me3(赖氨酸-4上的组蛋白H3三甲基化)的抗体可用来检测活跃表达的基因,而针对H3K27me3的抗体可用于检测沉默的基因。

类似的技术还包括RIP(RNA免疫沉淀)和MeDIP(甲基化DNA免疫沉淀)。RIP可以帮助人们鉴定,与特定RNA结合蛋白相连的RNA。而MeDIP技术允许研究者pull down甲基化的染色质序列。
 
一、提高染色质的质量

与绝大多数实验方法相同,ChIP也遵循着GIGO原则(Garbage in, garbage out)。如果你的染色质原材料不佳,当然就很难得到理想的实验结果。同时如果你的原材料OK,下一步片段化处理没有做好,仍然是徒劳。
 
目前人们一般通过超声或者酶切将染色质片断成几百Bp,但普通超声破碎仪很难拿捏。超声时间过长或力度过强都会令蛋白变性,使其与核酸分离或者破坏抗体识别的抗原表位。这种方案需要进行大量的优化,但过多的参数(比如四个需要考虑的关键参数:细胞密度、超声力度、超声时间和循环数)往往令人难以下手。幸亏目前有一款超声破碎仪,那就是Diagenode公司生产的Bioruptor 高通量非接触式超声破碎仪,他一次最多可以处理12个样品,由于它可以处理多个样品,把复杂的多参数影响直观数据化,解决了繁杂的参数误差,做到准确可控,快速获得最佳实验条件,从而获得更加准确的实验数据,很多科研人员称它为ChIP实验的神器、金标准,可谓名副其实。

另外有些科研人员喜欢用酶切的方法,酶切的方法其实可以加入超声步骤,超声有助于从细胞核释放更多的染色质。不过为了简单直接,单纯的酶切处理更为普遍。 要说明的是,酶学片段化方案也存在着一定的弊端,因为核酸酶有时会表现出序列偏好,从而影响结果的真实性。另外,酶学消化也并不总能与甲醛交联(ChIP的一个关键步骤)兼容。
 
二、保证抗体的质量  

用来进行pull-down的抗体,是成功ChIP的另一个关键因素。与Western blot相比核酸IP对抗体的要求更多。举例来
说,Western blot抗体识别的是变性蛋白。但在ChIP应用中,你需要确保抗体识别蛋白的三级结构或者一个暴露的抗原表位。

最好的办法是选择一款经ChIP(或RIP或MeDIP)验证的抗体。例如,Digenode公司提供一系列已验证的抗体。该公司致力于表观遗传学研究的服务领域,生产高品质的抗体,同时也为ChIP实验设计了Bioruptor系列超声剪切产品。确保使用高质量的抗体,是ChIP实验成功的关键,不可迁就,舍本求末。
 
三、控制细胞数

ChIP一般使用体外培养的细胞,每次反应所需的细胞量因地制宜。现在,人们常常需要研究更为特殊的样本,例如肿瘤、组织活检样本、干细胞、已存档的FFPE样本(甲醛固定石蜡包埋)、流式细胞分选或激光捕获显微切割所富集的细胞。在这些情况下实验所需的细胞量取决于研究的对象,组蛋白修饰比较丰富,需要的样本量也就相对较少。而转录因子丰度较低,一般需要大约一百万细胞,不过如果信噪比高,那么样本量也可以适当减少。

目前Bioruptor超声破碎仪最新型号PICO可以处理5ul的细胞溶液,同时由于是非接触式超声,不存在污染及损失,保证了实验材料的品质,更符合了ChIP神器的美誉。

上海博谊生物科技有限公司是比利时Diagenode公司高通量非接触式超声破碎仪的代理商,欲知更多产品详情,请联系我们。

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