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双向电泳常见问题解答

双向电泳常见问题解答

双向电泳常见问题解答

随着人类基因组草图完成,蛋白质组研究全面展开。作为经典蛋白质组学分离技术,双向电泳越来越被科研人员所熟知。但要想得到漂亮的双向电泳谱图,却并不那么容易。我们将针对双向电泳过程中常出现的问题进行总结,希望能给您的实验带来帮助。

本期我们重点关注双向电泳图谱中常出现的水平条纹。双向电泳水平条纹的产生主要来自于样品本身和一向等电聚焦电泳,下面就从这两方面的原因及其解决办法进行详述。

一、样品制备问题

1.样品中存在影响等电聚焦的杂质

蛋白样品中任何离子净电荷的污染都将影响等电聚焦,并引起水平条纹。严重的污染物干扰,我们在等电聚焦过程中可以观察到:低电压运行时,软件和仪器监测到的电流很快就达到50 µA的限定,预设的高电压不能达到;严重时可能导致电弧产生或IPG胶条燃烧。常见的污染包括样品制备过程中引入的盐和其他带电小分子、去污剂;以及样品本身内源性的杂质,包括各种内源性的带电小分子,核酸、多糖、脂类、酚类等非蛋白杂质。了解样品中主要污染物的组成,并且在样品制备过程中采取有针对性的办法去除污染物即可改善水平条纹。

盐和带电小分子:水化上样将盐离子浓度降低到10 mM以下,而杯上样则限制样品盐浓度不超过50 mM。脱盐常用脱盐柱、旋转透析或透析袋;而用TCA和丙酮沉淀再重悬,是一个更有效的脱盐方法,但往往TCA清除不尽,蛋白复溶效率不高。2-D Clean-Up Kit (货号80-6484-51)则采用专利的共沉淀剂和洗涤附加物,可以定量沉淀各种来源的蛋白质,蛋白复溶率通常大于90%。使用2-D Clean-Up Kit不会造成斑点增加或减少,或斑点位置的变化,操作简单,整个过程可以在一个小时内完成。另外,使用劣质水、尿素或其他试剂也会造成导电性升高;尿素还易分解为带电的产物。选用优质试剂,重要的试剂包括尿素、硫脲、DTT、去污剂、载体两性电解质、水等,防止一向等电聚焦所需的这些试剂因本身纯度不够,而引入带电杂质。即使选择了优质尿素、硫脲,保存得当也非常关键。尿素、硫脲吸水后会发生离子化,影响等电聚焦。样品中盐离子浓度还可以通过改变IEF的程序来降低。先设一步或几步低压程序,如100V 3h,100v---1000v gradient 3h,然后再升高电压完成IEF,这个低压程序可以使样品中的离子首先迁移到IPG胶条的末端,降低电内渗,减少水平条纹的形成。

带电荷的去污剂:最常用的离子型去污剂如SDS,能够包被蛋白,并彻底改变它们的净电荷,最终影响它们的等电点,导致条纹出现以及IPG胶条中样品的损失。如果在样品中存在SDS,那么其用溶胀液稀释后的最终浓度不能超过0.25%。或者,添加其他非离子型去污剂或兼性离子去污剂稀释 SDS的浓度。

核酸:样品的核酸污染也会导致水平条纹的出现。高分子量的核酸还会堵塞胶孔,阻碍聚焦。许多蛋白与核酸结合,产生了蛋白-核酸的混合物,每个都有着不同的等电点。在等电聚焦之前用核酸酶(货号80-6501-42)处理样品,可去除样品中的核酸。或者在样品制备时超声剪切核酸,也可在精胺存在时通过超速离心也可去除核酸。

多糖:唾液酸、带负电荷的多糖也能产生与核酸类似的水平条纹。不带电荷的多糖通过阻塞凝胶孔,阻碍样品进入IPG胶条,导致条纹出现。去除多糖用TCA/acetone (Damerval et al. 1986),或者醋酸铵(甲醇饱和硫酸铵)沉淀然后用苯酚抽提(Hurkman and Tanaka 1986)。

2. 蛋白被修饰——氨基甲酰化


为了防止蛋白质的修饰,不要在加入尿素后加热样本。如果样本中存在尿素,溶液温度不能超过37°C。温度上升会使尿素水解为异氰酸酯,异氰酸酯能通过氨基甲酰化作用(carbamylation)对蛋白质进行修饰,使个别蛋白产生电荷异质性,造成人为的“斑点串(charge trains)”。蛋白样品应当使用高纯度尿素制备,切勿加热至30°C以上。

3.二硫键形成


二硫键形成也是样品制备方面导致水平条纹的一个重要原因。在双向电泳之前,若蛋白样品中存在二硫键,则它们是随机存在于分子内部或分子之间的。二硫键形成产生了多种蛋白构象,包括较小的pI变体(在双向凝胶上显示为单个蛋白点的变宽)以及同一蛋白的多聚物(以点、幻影点、缺失点的条纹尾和拖尾出现)。防止二硫键的形成能避免这些问题。二硫键问题在两种情况下特别严重:1)碱性蛋白的分析,2)较长IPG胶条的使用。样品制备过程中加还原剂,如DTT,可打开二硫键,需要注意的是DTT在IEF过程中会迁移而使蛋白发生再氧化。对于碱性蛋白,采用DeStreak去拖尾试剂(货号17-6003-18)和DeStreak去拖尾水化液,可将蛋白质巯基团转变为稳定的二硫化物基团,防止发生非特异性氧化反应。结合在酸性端杯上样可有效减少碱性蛋白聚焦过程中产生的水平条纹。

4.蛋白溶解度差


未能彻底溶解样品中的所有蛋白将引起水平条纹。双向电泳最常用的样品缓冲液中主要组分是尿素、非离子去污剂(如NP-40)或兼性离子去污剂(如CHAPS)及还原剂(如DTT)。此混合物中包含的其他组分,如硫脲或新型去污剂,如氨基硫代甜菜碱家族(如ASB-14)能改善膜蛋白的溶解性。这些试剂的综合作用是通过更好地溶解蛋白的疏水区域以减少因蛋白中的氢键或与IPG凝胶基质的相互作用而产生的聚集。另外,在等电聚焦前通过离心去除不溶蛋白也是一种好的做法,能防止它们干扰其他蛋白进入凝胶基质。

二、等电聚焦问题

1.上样量太高或存在高丰度蛋白


IPG胶条的载样量通常取决于胶条的长度、pH范围以及所使用的染色方法。下表列举了各种不同胶条推荐的上样量。高丰度蛋白存在的样品需要更多考虑。人血清中的白蛋白占蛋白质总量的70~90%,IgG占10~25%。利用白蛋白和IgG去除试剂盒(货号28-9480-20和28-9466-03)可选择性地与人白蛋白和IgG结合并去除,从而改善低丰度蛋白质的分辨率,增加样本的斑点数量。另外,使用杯上样的方法上样时,上样量过大,可能会导致高丰度蛋白过载,从而使蛋白聚集。这会导致某一蛋白在等电点(pI沉降)沉淀,并引起水平条纹。因此,杯上样时需要限制蛋白浓度不超过10mg/ml。

表. IPG胶条推荐载样量

胶条长度

(pH)

推荐上样量(µg)

银染

考染

7

3-11NL, 3-10NL, 3-10

3-6

30-60

 

4-7

4-8

25-150

 

3-5.6NL, 6-11, 7-11NL

8-16

40-240

13

3-11NL, 3-10NL, 3-10

10-20

50-240

 

4-7

15-30

75-450

 

3-5.6NL, 6-11, 7-11NL

30-60

150-900

18

3-11NL, 3-10NL, 3-10

20-40

100-500

 

4-7

30-60

150-900

 

3-7NL, 6-9, 6-11

60-120

300-1500

24

3-11NL, 3-10NL, 3-10

30-60

200-600

 

4-7

45-90

200-1300

 

3-5.6NL, 3-7NL, 6-9, 7-11NL

80-170

400-2000

2.聚焦不足

不完全聚焦也会引起水平条纹。确保总的伏特小时数适用于所使用IPG胶条的长度和pH范围,并根据上样量进行调节。因此,不同长度和pH范围的胶条不能同时电泳。另外,等电聚焦程序设置了总电流的限制-50uA/胶条,多根胶条同时聚焦时,如果某个样品离子较多,它将承载大部分电流,减慢了其他蛋白样品的聚焦。这导致不完全聚焦和水平条纹的出现。因此,电导率相差很大的样品应当单独运行IEF。

3.聚焦过度


延长聚焦时间不一定能提高分辨率。实际上,它可能引起水平条纹。一些蛋白样品更易聚焦,因此必须对每个样品类型及每种缓冲液独立开展伏特小时数的优化,以确定稳态的IEF模式。

总之,样品制备和等电聚焦是双向电泳谱图出现水平条纹的最主要的原因。除此之外,如果平衡缓冲液或覆盖胶条的琼脂糖中存在杂质,也可能使整个胶上出现横条。这就需要配制新鲜干净的琼脂糖和平衡缓冲液。并且,IPG干胶条的水化也非常关键,通常水化时间要在10h以上。保证整个胶条均匀、充分溶胀也是去除水平条纹必需的。

 

 
 
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